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2月22日，国际学术期刊《Journal of Clinical Investigation》杂志在线发表了复旦大学上海医学院医学分子病毒学重点实验室袁正宏课题组与复旦大学附属公共卫生临床中心科学研究部慢性乙型肝炎研究组、肝炎科、病理科共同合作的题为“In situ analysis of intrahepatic virological events in chronic hepatitis B virusinfection”(《慢性乙型肝炎病毒患者肝内病毒学事件的原位分析》的研究论文，研究揭示了乙肝病毒在患者体内不为人知的“生活方式”。张小楠、陆伟为论文共同第一作者，袁正宏研究员与张占卿研究员为论文共同通讯作者。
《Journal of Clinical Investigation》杂志今年3月刊将正式报道上述研究结果，并作为“亮点论文”进行重点推荐，邀请了国际著名乙肝专家、澳大利亚维多利亚传染病参比实验室研究部主任Stephen Locarnini和Peter Revill教授作专题评论。
乙型肝炎病毒是一种严重影响人类健康的病原体，也是引发慢性乙型肝炎(慢乙肝)的元凶。根据国际卫生组织2015年最新估计，全球约有2.4亿慢乙肝患者，大多分布在低收入及中等收入国家，每年约有65万患者死于慢乙肝感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌。在我国，现有9300万慢乙肝感染者，在肝硬化和肝细胞癌患者中，由乙肝病毒引发的比例分别高达60%和80%。随着我国乙肝疫苗接种的推行，我国婴幼儿的乙肝阳性率有了大幅度的降低。然而，对于其他已经感染病毒者，仍缺乏彻底治愈的疗法，从而给大量家庭带来了沉重的经济负担和健康威胁。大量临床与基础研究表明，慢乙肝长期迁延不愈的根本原因在于乙肝病毒共价闭合环状DNA (cccDNA)在肝内的长期存在以及随之造成的病毒表面抗原血症。由于cccDNA在慢乙肝患者肝脏中的水平极低，传统分子生物学方法(如Southern印记、cccDNA特异性聚合酶链反应)不仅检测困难，而且无法显示其组织内分布特点。鉴于目前乙肝cccDNA研究存在的问题，在袁正宏研究员指导下，公卫中心科学研究部张小楠博士在bDNA信号扩增技术基础上进行二次开发，成功建立了一种能够在组织水平显示cccDNA分布的原位杂交技术。该技术还能显示乙肝病毒的其他复制中间体，如前基因组RNA (pgRNA)、松弛环状DNA(rcDNA)在单细胞水平分布情况。研究组将该原位杂交与乙肝病毒主要抗原的免疫组织化学染色结合，获得了病毒核酸与蛋白质的综合图像。令人意外的是，乙肝病毒抗原与核酸在单细胞水平呈现惊人的“马赛克状”分布，即病毒的ccc DNA、RNA与表面抗原均显示极为显著的负相关关系。研究进一步证实，经过一年以上抗病毒治疗的患者肝细胞内仍存在乙肝病毒的ccc DNA。综合前人研究发现和本课题基于大量患者样本的观察结果，研究组提出在单细胞水平乙肝病毒存在“抗原富集期”、“DNA富集期”和“潜伏期”的“三阶段”假说，推测患者体内肝细胞生理水平和病毒复制活跃度的变化可以导致这三个阶段的相互转换。该假说在单细胞水平描述了病毒生活周期的复杂变化模式，丰富了学术界对乙肝病毒肝内生活史的认识，为进一步针对患者不同病情设计清除乙肝病毒ccc DNA的新策略提供了理论基础。
据袁正宏研究员介绍，该研究建立的乙肝病毒cccDNA原位杂交技术不仅对深化重要的基础研究具有较大价值，同时也具有广阔的应用前景。该方法可以用来监测慢乙肝患者抗病毒治疗后cccDNA的清除情况，从而为评价抗病毒药物清除病毒的潜力提供了重要的技术平台。目前，研究组正着手该方法的进一步开发，将其作为乙肝病毒分子病理检测方法进行推广应用，为临床医师综合评价患者肝内病毒学状态提供参考。
慢乙肝感染在单细胞水平的“三阶段”假说
慢乙肝患者肝组织cccDNA(蓝紫色)与HBsAg(棕色)共染色典型结果
原文链接：
In situ analysis of intrahepatic virological events in chronic hepatitis B virus infection
原文摘要：
Persistent hepatitis B virus (HBV) infection is established by the formation of an intranuclear pool of covalently closed circular DNA (cccDNA) in the liver. Very little is known about the intrahepatic distribution of HBV cccDNA in infected patients, particularly at the single-cell level. Here, we established a highly sensitive and specific ISH assay for the detection of HBV RNA, DNA, and cccDNA. The specificity of our cccDNA probe set was confirmed by its strict intranuclear signal and by a series of Southern blot analyses. Use of our in situ assay in conjunction with IHC or immunofluorescence uncovered a surprisingly mosaic distribution of viral antigens and nucleic acids. Most strikingly, a mutually exclusive pattern was found between HBV surface antigen–positive (HBsA-positive) and HBV DNA– and cccDNA-positive cells. A longitudinal observation of patients over a 1-year period of adeforvir therapy confirmed the persistence of a nuclear reservoir of viral DNA, although cytoplasmic DNA was effectively depleted in these individuals. In conclusion, our method for detecting viral nucleic acids, including cccDNA, with single-cell resolution provides a means for monitoring intrahepatic virological events in chronic HBV infection. More important, our observations unravel the complexity of the HBV Lifecycle in vivo.
作者：袁正宏 点击：次